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楤木皂苷抑制内毒素导致的心肌损伤和焦亡

殷玥 陈迈 余璐

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楤木皂苷抑制内毒素导致的心肌损伤和焦亡

    作者简介: 殷玥,助理实验师,硕士 Email:yiny@qq.com.
    通讯作者: 余璐, yulu@fmmu.edu.cn
  • 中图分类号: R542.2

Saponins extracted from Aralia Taibaiensis attenuates endotoxin-induced cardiac injury and pyroptosis

    Corresponding author: Lu YU, yulu@fmmu.edu.cn
  • CLC number: R542.2

  • 摘要: 目的 内毒素(LPS)导致的心功能障碍是脓毒血症患者死亡的重要原因。本研究旨在探讨采用楤木皂苷(saponins extracted from Aralia taibaiensis,sAT)能否抑制LPS导致的心肌损伤和心肌细胞焦亡。 方法 将雄性C57/BL6小鼠随机分为:正常对照组,sAT对照组,LPS组和LPS+sAT组,每组8只。采用sAT [240 mg/(kg·d),7天]灌胃后腹腔注射LPS (15 mg/kg),于24小时后检测心脏功能,同时测定各组炎症因子水平;Western blot检测caspase-11的表达。细胞学实验采用H9C2心肌细胞给予LPS结合常规焦亡刺激物—霍乱毒素B型亚单位(CTB)诱导心肌细胞焦亡,检测sAT对H9C2细胞存活率及细胞培养上清中IL-1β,LDH水平和细胞caspase-11水平的影响。 结果 与对照组相比,LPS导致心功能指标显著降低,血浆CK-MB显著升高,死亡率增高,心肌组织中炎症反应显著增强(P < 0.05)。给予sAT处理可显著改善LPS所导致的心功能障碍并抑制炎症反应,与LPS组相比,降低LPS组小鼠的死亡率(P < 0.05)。LPS可导致心肌组织出现细胞焦亡特征,表现为心肌caspase-11活化,IL-1β水平升高和血浆LDH水平显著升高;sAT处理可有效抑制LPS导致的心肌细胞焦亡。细胞学实验证实,LPS结合CTB可诱导H9C2心肌细胞焦亡,sAT处理可有效抑制细胞caspase-11活化,有效降低细胞培养上清中的IL-1β和LDH水平,显著提高细胞存活率。 结论 sAT能够抑制LPS导致的心肌损伤和心功能障碍,并有效抑制心肌细胞焦亡。
  • 图 1  sAT改善LPS暴露后的心脏功能

    图 2  sAT抑制LPS导致的心肌组织炎症反应

    图 3  sAT抑制LPS导致的心肌组织中的细胞焦亡

    Figure 3.  1:正常对照组;2:sAT对照组;3:LPS组;4:LPS + sAT组。n = 8。与对照组相比,aP < 0.05;与LPS组相比,cP < 0.05

    图 4  sAT直接抑制LPS导致的H9C2心肌细胞焦亡

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-09
  • 录用日期:  2019-10-25
  • 网络出版日期:  2019-12-06
  • 刊出日期:  2019-12-01

楤木皂苷抑制内毒素导致的心肌损伤和焦亡

    通讯作者: 余璐, yulu@fmmu.edu.cn
    作者简介: 殷玥,助理实验师,硕士 Email:yiny@qq.com
  • 1. 基础医学院生理与病理生理学教研室 第四军医大学
  • 2. 西京医院心血管内科 第四军医大学
  • 3. 西京医院病理科,陕西 西安 710032

摘要:  目的 内毒素(LPS)导致的心功能障碍是脓毒血症患者死亡的重要原因。本研究旨在探讨采用楤木皂苷(saponins extracted from Aralia taibaiensis,sAT)能否抑制LPS导致的心肌损伤和心肌细胞焦亡。 方法 将雄性C57/BL6小鼠随机分为:正常对照组,sAT对照组,LPS组和LPS+sAT组,每组8只。采用sAT [240 mg/(kg·d),7天]灌胃后腹腔注射LPS (15 mg/kg),于24小时后检测心脏功能,同时测定各组炎症因子水平;Western blot检测caspase-11的表达。细胞学实验采用H9C2心肌细胞给予LPS结合常规焦亡刺激物—霍乱毒素B型亚单位(CTB)诱导心肌细胞焦亡,检测sAT对H9C2细胞存活率及细胞培养上清中IL-1β,LDH水平和细胞caspase-11水平的影响。 结果 与对照组相比,LPS导致心功能指标显著降低,血浆CK-MB显著升高,死亡率增高,心肌组织中炎症反应显著增强(P < 0.05)。给予sAT处理可显著改善LPS所导致的心功能障碍并抑制炎症反应,与LPS组相比,降低LPS组小鼠的死亡率(P < 0.05)。LPS可导致心肌组织出现细胞焦亡特征,表现为心肌caspase-11活化,IL-1β水平升高和血浆LDH水平显著升高;sAT处理可有效抑制LPS导致的心肌细胞焦亡。细胞学实验证实,LPS结合CTB可诱导H9C2心肌细胞焦亡,sAT处理可有效抑制细胞caspase-11活化,有效降低细胞培养上清中的IL-1β和LDH水平,显著提高细胞存活率。 结论 sAT能够抑制LPS导致的心肌损伤和心功能障碍,并有效抑制心肌细胞焦亡。

English Abstract

  • 脓毒血症(sepsis)可导致多器官功能衰竭和严重的心血管功能异常,其死亡率高,预后差且缺乏有效的药物治疗[1]。心脏功能障碍在脓毒血症早期即存在并且显著增加脓毒血症患者死亡率,临床观察中发现有很大比例的脓毒血症患者出现左室收缩舒张功能障碍[2]。因此,深入探讨脓毒血症导致心肌损伤的病理学机制和有效的防治措施始终是重要的临床问题。

    以往研究证实,脓毒症引发机体严重的炎症反应介导细胞死亡。焦亡(pyroptosis)又被称为细胞炎性坏死,是一种新发现的炎症性的程序性细胞死亡[3]。细胞焦亡表现为细胞膜形成孔洞,大量细胞内容物释放进而激活强烈的炎症反应。来自邵峰实验室的研究证实,小鼠细胞中的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-11是内毒素脂多糖(LPS)的胞内受体,在结合LPS之后发生寡聚而活化,进而导致炎症因子白介素(IL)-1β以及乳酸脱氢酶(LDH)的释放[2, 4]。目前,细胞焦亡在脓毒症引起心肌损害过程中的作用尚待深入研究。

    太白楤木特产于秦巴山区,我国传统医学发现太白楤木具有活血散瘀、镇痛消炎等功效[5]。前期研究显示,楤木皂苷提取物(saponins extracted from Aralia taibaiensis,sAT)抑制炎症反应、提高机体耐缺氧的能力和心肌保护作用[6]。但是,sAT改善脓毒症引起的心肌损害尚未见报道。本研究旨在探讨sAT在LPS诱导的小鼠急性心肌损伤模型中的作用,并探讨其对心肌细胞焦亡的影响。

    • 成年(2月龄)雄性C57BL/6小鼠由第四军医大学实验动物中心提供。太白楤木皂苷(sAT)来自第四军医大学西京医院药剂科奚苗苗教授课题组[6]。脂多糖(LPS)购自美国Sigma-Aldrich公司。小鼠CK-MB检测试剂盒和MPO检测试剂盒购自中国南京建成生物工程公司。小鼠IL-1β ELISA试剂盒和IL-6 ELISA试剂盒购自中国联科生物公司。霍乱毒素B亚单位(CTB)购自中国爱必信公司。LDH检测试剂盒(Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)购自美国Promega公司。Caspase-11抗体购自美国Novus Biologicals (Littleton, CO)公司。图像分析软件Image-Pro Plus 6.0及Bio-Rad凝胶成像系统来自美国Bio-Rad公司。心脏超声仪(VEVO2100高分辨活体成像系统)购自加拿大VisualSonics公司。

    • C57BL/6小鼠随机分为:正常对照组,sAT对照组,LPS组和LPS+sAT组,每组8只。采用sAT [240 mg/(kg·d)]灌胃7天后,腹腔注射LPS (15 mg/kg,100 µl),于24小时后检测心脏功能。功能学检测完成后动脉取血,EDTA抗凝后以5 000 r/min离心15分钟分离血浆,分装后置−80 ℃冰箱保存备用;提取心脏组织用于后续实验。

    • 各组小鼠麻醉后仰卧位固定进行心脏超声心动图检查。测定左心室搏动图像,获得M型超声心动图,保存后分别测量左室收缩末内径(LVESd)、左室舒张末内径(LVEDd),并通过公式计算左室缩短分数(LVFS)和左室射血分数(LVEF),超声检查的操作及分析均采用双盲法。

    • 用裂解液提取心肌组织和培养的心肌细胞总蛋白,BCA法定量后进行蛋白电泳,转膜。分别加入Caspase 11抗体(1:10 000)孵育,室温摇床2小时后4 ℃过夜,内参选择Tublin(1:1 000)。TBST洗膜后加入稀释羊抗兔二抗(1:5 000)孵育,室温摇床1小时后,TBST洗膜。加入ECL显色液孵育,暗室内胶片显影。根据分子量确定pro-caspase 11 (45 kDa)和cleaved-caspase 11 (20 kDa)。

    • H9C2心肌细胞株购于ATCC公司,按1 × 105/mL的密度接种于培养瓶中,以含100 ml/L小牛血清DMEM为培养基,置于37 ℃、50 ml/L CO2孵箱中培养,每(2 - 3)d更换1次培养基。待细胞达到 (80-90)%融合度时,用含乙二胺四乙酸的2.5 g/L胰酶消化并进行传代培养,接种于Corning 6孔培养皿中培养24 h后观察长势良好即予以更换无血清培养基,继续培养12 h,后将细胞按不同处理方式分为4组:①正常对照组(Control group):正常培养,不使用任何药物刺激;②sAT对照组:终浓度50 µg/ml的sAT处理16 h;③LPS + CTB组:细胞培养基中加入LPS溶液至终浓度为100 ng/ml,6 h后加LPS溶液至终浓度为1 µg/ml,同时加CTB溶液至终浓度为10 µg/ml,16 h后收集细胞;④LPS + CTB + sAT组:在LPS + CTB诱导细胞焦亡的同时给予50 µg/ml的sAT处理。焦亡诱导处理完成后收取细胞培养上清用于细胞因子检测。在H9C2心肌细胞每孔加20 μl MTT溶液,置于37 ℃避光反应4小时,每孔加100 μl DMSO,震荡10分钟。蓝色结晶体完全溶解后,用酶标仪检测各孔在490 nm处的吸光度值。通过吸光度计算各组细胞相对生存率。

    • 采用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析,实验数据以均数±标准差表示。组间数据比较采用单因素方差分析(ANOVA),若总体差异显著, 再以SNK-q检验分析相应两组间显著性差别。以P ≤ 0.05为差异显著界限为差异具有统计学意义。

    • LPS暴露24小时后小鼠出现明显的心脏收缩舒张功能障碍,与对照组相比,LPS组小鼠左室LVEF和LVFS值均显著降低(P < 0.05);与LPS组相比,在sAT处理组小鼠左室LVEF和LVFS值得到显著提高(P < 0.05),sAT处理还显著降低了LPS所升高的血浆CK-MB水平,有效提高LPS暴露之后(7天)的小鼠总体生存率(P < 0.05),见图1

      图  1  sAT改善LPS暴露后的心脏功能

    • 检测心肌组织炎症因子发现,与对照组相比,LPS导致心肌组织中炎症因子IL-6水平显著升高(P < 0.05),LPS暴露24小时导致心肌组织中MPO水平显著升高(P < 0.05);sAT处理可有效抑制LPS导致的心肌组织炎症反应,与LPS组相比,降低IL-6和MPO水平(P < 0.05),见图2

      图  2  sAT抑制LPS导致的心肌组织炎症反应

    • 本研究发现,LPS暴露24小时与对照组相比,心肌组织中出现活化型Caspase(Cleaved casp)-11,IL-1β升高和循环水平LDH升高(P < 0.05);与LPS组相比,sAT处理可显著抑制LPS暴露后心肌中Cleaved casp-11水平,降低心肌组织中IL-1β水平和降低循环水平LDH的释放(P < 0.05),见图3

      图  3  sAT抑制LPS导致的心肌组织中的细胞焦亡

      Figure 3.  1:正常对照组;2:sAT对照组;3:LPS组;4:LPS + sAT组。n = 8。与对照组相比,aP < 0.05;与LPS组相比,cP < 0.05

    • 采用LPS联合焦亡刺激物CTB培养16小时诱导H9C2细胞焦亡结果显示,与LPS+CTB组相比,50 µg/ml的sAT处理可有效抑制H9C2细胞焦亡标志物的水平,降低Cleaved casp-11水平,降低培养上清中IL-1β水平和LDH的释放,显著提高了心肌细胞的存活率(P < 0.05),见图4

      图  4  sAT直接抑制LPS导致的H9C2心肌细胞焦亡

    • 本研究发现SAT可减轻内毒素诱导的急性心肌损伤,改善心脏功能。sAT的心肌保护作用与抑制心肌组织中的炎症反应密切相关。并且,本研究证实sAT可有效抑制LPS诱导的心肌细胞焦亡,最终提高整体动物的存活率。本研究提示了SAT新的药理学效应,SAT的抗细胞焦亡效应可能在脓毒症心肌保护中具有重要的应用价值。

      脓毒血症是全身性剧烈的炎症反应综合征,心脏是脓毒血症状态下主要的受损器官并且后果严重[8]。临床研究显示:近50%的脓毒血症患者早期就存在心功能不全,但脓毒性心肌损伤的具体机制仍待深入阐明[9]。本研究发现,在LPS导致心肌损伤的模型中存在典型的细胞焦亡特征。该结果提出了新的观点:心肌细胞焦亡是脓毒性心肌细胞损伤的重要组成部分。焦亡的概念最早由Cookson[10]于2001年提出是一种炎症性的细胞程序性死亡方式。细胞焦亡的出现往往伴有大量的炎症因子释放和机体炎症反应。细胞焦亡被认为由两种含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase所介导,包括经典途径的caspase-1和非经典途径的人体细胞的caspase-4/5和小鼠的caspase-11。来自邵峰实验室的研究发现[4, 11],小鼠的caspase-11可以被LPS所活化诱导细胞凋亡,在内毒素休克和革兰氏阴性菌诱导的败血症中发挥非常重要的作用。在本研究中明确显示,LPS导致心肌细胞caspase-11活化,出现细胞焦亡特征;抑制细胞焦亡可有效改善心脏功能显著提高存活率。因此,针对心肌细胞焦亡开展脓毒性心肌损伤的防治研究是值得探讨的新方向。

      太白楤木是我国西部地区资源丰富的一种药用植物,具有活血止痛、祛风除湿的功效。太白楤木化学成分复杂,在前期研究中发现太白楤木干燥根皮或茎皮中提取出的sAT具有降血糖降血脂作用,心脑保护作用,抗氧化作用以及抗机体衰老作用等[5, 12, 13]。由于sAT直接进入血液会引发溶血反应,相关研究比较了口服不同浓度的sAT的心肌保护作用量效关系,研究结果证实240 mg/(kg·d)的sAT灌胃处理7天可有效发挥心肌保护作用[5, 6]。sAT还可抑制心肌缺血再灌注损伤[6],但是,sAT对LPS导致的心肌焦亡的作用以往并未报道。在本研究中发现:在整体动物水平,sAT[240 mg/(kg·d)]预处理可有效抑制心肌组织在LPS诱导后的细胞焦亡表现,提示了sAT预处理可能通过抑制过度的炎症反应,抑制强烈炎性反应导致的心肌组织中的细胞焦亡。并且,本研究还通过细胞学实验观察了sAT对心肌细胞焦亡的直接作用,sAT有效抑制了LPS联合焦亡刺激物CTB所诱导的H9C2细胞焦亡,具有直接的心肌保护作用。本研究通过在体和离体实验提示了sAT心肌保护作用的新效应,sAT可能具有预防和治疗心肌细胞损伤的多重有益作用。

      因此,通过整体动物和细胞学实验本研究发现sAT可抑制LPS所导致的心肌损伤和焦亡。本研究提出的sAT心肌保护作用可能的新机制,为sAT的临床应用提供了实验依据。

参考文献 (13)

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